空调系统用铜代替铝预防真菌传播的应用前景

L. Weaver1, H.T. Michels2 和 C.W. Keevil1
1 Environmental Healthcare Unit, University of Southampton, Biomedical Sciences Building,
Bassett Crescent East, Southampton, UK
2 Copper Development Association Inc., New York, NY, USA

关键字
空调, 抗真菌, 曲霉菌，念珠菌, 铜, FUN-1, 镰刀霉, 青霉菌

通信地址
Dr Louise Weaver, Institute of Environmental Science and Research Limited, Christchurch Science Centre, 27 Creyke Road, Ilam Christchurch 8041, New Zealand.

电子邮件: louise.weaver@esr.cri.nz

2009/ 1277： 2009 年7月16日收稿并修订， 2009 年9 月11日录用
doi:10.1111/j.1472-765X.2009.02753.x

摘要

目的：专家建议铜作为抑菌表面材料，针对可以替代空调系统中铝的铜材料，我们测试了铜作为抗真菌表面材料的有效性。

方法与结果：取若干铜（C11000）和铝样片，分不同时间段在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上培育真菌分离株（曲霉菌, 镰刀菌, 产黄青霉和白色念珠菌），并使用荧光染色 FUN-1 原位活性检测技术确定孢子是否存活。结果表明，与铝材料测试相比，铜材料上的菌群死亡率增加。此外，铜还能够阻止已有孢子的萌发，从而能够降低孢子释放风险。

结论：铜材料能够提供抑菌表面，可防止已有孢子萌发。采用FUN-1分析显示铜上的真菌孢子进入不可培养（VBNC）的活性状态，说明采用本文实验方法进行抑菌能力评估的重要性，单独采用培育分析方法可能得出错误实验结论。

研究意义及影响：在各类建筑物尤其是病人更容易受到真菌感染的医院环境中，在空调系统中使用铜作为铝替代材料非常具有实用价值。

引言
        空气中传播的真菌孢子对建筑物环境产生影响，特别是在医院环境中，病人更容易受到真菌感染。真菌感染可能危及生命，即使安装空气过滤系统，这些感染控制措施也已被证明难以奏效。真菌孢子的传播途径之一是通过空调系统，这类空调系统广泛应用于各类建筑物和医院重症监护病房（Perdelli等，2006）。发达国家中人们处于室内环境中的时间日益增加，估计 90％ 以上，并因此可能导致不良建筑物综合症（Li 等，2007）。此前有研究发现，使用供暖、通风和空调（HVAC）系统可以改善办公室空气质量，但同时需要重视系统维护工作重要性（PARAT 等，1997）。

        人们在分析通风系统在各类建筑物室内空气传染性病原体传播过程中所充当的角色时，论证过程缺乏确凿的文献依据，说明需要对医院和工作环境环问题开展进一步研究（Li 等，2007）。然而，研究也确实认为有足够的证据证明建筑物通风系统和空气中传染性病原体传播之间存在联系。
        有迹象表明，真菌本身具有抵抗金属离子破坏的生物机制，包括使用细胞壁包封，改变金属吸收，通过分泌代谢物产生螯合和沉淀作用，以及利用金属硫蛋白进行细胞内粘合（Gadd，1993）。最近的研究表明，水生真菌可以通过启动抗氧化防御系统产生铜离子耐受性（Azevedo等，2007）。

        由于铝材料具有传热性好、抗腐蚀性好和重量轻等特点，被广泛应用于HVAC系统，尤其是空调机组内翅片部件设计中，但采用铝材料所导致的潜在健康问题却被忽视了。事实上，在空调机组内采用铝翅片将无法防止真菌孢子传播并可能增加菌群数量。作为铝的替代材料铜，除了具备铝材料的众多良好属性之外，还可作为抑菌表面材料杀灭细菌和病毒（Wilks等，2005，2006；Noyce等，2006，2007； Weaver等，2008）。虽然人们已知铜离子具有抑菌能力，但令人惊讶的是人们尚未就铜作为抑菌固体表面这一研究领域开展广泛调研工作。因此，采用铜替代铝作为空调系统翅片部件制造材料从而提供抑菌性能，该方案具有应用前景。

实验方法

培育准备
       在 25 (+2)°C 温度环境下用马铃薯葡萄糖琼脂（默克公司）培养真菌株直到可以观察到菌株与孢子融合生长。生长期间注意避免培养皿污染。使用消毒的接种环将孢子菌丝从培养皿上刮下并浸入 1 毫升真菌稀释液，GHD（葡萄糖 HEPES 稀释剂）中（2％ 葡萄糖和 10 毫摩尔/升HEPES钠盐混合溶液，pH 值 7.2）。使用 X100 显微镜计数每毫升孢子数量。
样片准备
        将铜条 (厚度0.5 mm，统一编号系统 C110000) 和铝条材料切成 10 mm X 10 mm 样片。将金属样片在丙酮溶液内清洗，然后放入 70％ 乙醇内备用。使用前将样片进行灼烧处理，然后置于无菌Petri培养皿中。

样片接种
       使用培养或原位染色方法对各暴露时间段的样片进行分析，吸取 20 µl 孢子悬液滴在样片上，并在环境温度和湿度下暴露不同时间（0，3，6，24，48，96，120，168 和 576 小时），每个样片重复测量2次。
 

培养结果分析
       暴露不同时间后，将样片放入 5ml 含 20-30个直径 2 毫米玻璃微珠的GHD溶液内，涡轮搅拌 1 分钟。准备多份GHD稀释液，分三份将 100 il 稀释剂涂抹在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）上。22 (+2)°C 温度环境下将培养皿进行密封孵化 7 天 (直到可以对菌群进行计数)。对每个培养皿上菌落肉眼计数，得出每样片（平方厘米）分布的菌落数量。
荧光显微镜技术
        将经过规定时间暴露处理的双份样片在无菌环境下进行干燥（II 级微生物安全柜）。经过干燥处理后，将 50 µl FUN-1（Invitrogen公司）滴在样片上，在22 (+2)°C，潮湿环境孵育1.5 小时。染色后，用过滤后的无菌去离子水轻轻冲洗去除染料。干燥处理后，使用配备荧光技术（EDIC/EF显微镜）（尼康Eclipse型ME600；Best Scientific 公司，英国）和 X400 倍率的宽带 TRITC 滤波器（Keevil，2003）的表面差异对照显微镜。将数码相机 (Coolsnap CF 型号; Roper Industries 公司, UK) 连接至装有数码图片分析软件 (IMAGE-FRO pius 软件, 版本4.5.1.22；Media Cyber¬netics公司, UK) 的计算机上，进行拍照 (至少10个区域，覆盖200个孢子)。使用 Image-Pro 软件统计总孢子数 (绿色和橙色/红色荧光) 和具代谢活性孢子数 (橙色/红色荧光)。将每可见区域孢子数量乘以所含区域数量，从而计算得出每个样片（平方厘米）上的代谢活性孢子数。
结果

培养结果分析
        铜能够影响除黑曲霉以外其他所有真菌的存活率，黑曲霉在经过576小时（24天）暴露后仍未观察到显著死亡现象（表1）。白色念珠菌、黄色镰孢菌、尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和产黄青霉最快发生死亡，实验表明这些真菌种类在铜样片暴露处理 24 小时后全部死亡（表1）。曲霉菌类真菌对铜适应性较强。黄曲霉和烟曲霉分别为120和144小时暴露处理才能完全死亡。
 

Geomean 几何均数

荧光显微镜技术
       使用FUN-1活性染色技术比较铜和铝上面的曲霉菌孢子存活情况，研究表明两种样片上的孢子存活情况相似（表1）。需要注意的是，虽然两种金属样片上的孢子生存情况并无显著差异，但观察发现铜样片上的孢子在实验期间未发生萌发，而铝样片上的孢子发生快速萌发，并在样片表面蔓延菌丝（图 1）。
       观察发现镰刀菌孢子铜样片存活率与低于铝样片存活率，实验120小时后，铜上无活性孢子（表1）。与培养分析结构相比，该生存期较长，说明 24 小时后真菌在铜上未发生生长。同样，当使用 EDIC/ F 显微镜观察时，在铜样片上未发现孢子萌发，但在铝样片上发现萌发现象。使用 FUN-1 染色技术同样也发现产黄青霉和白色念珠菌在铝样片上具有较长生存时间（表1）。
        为进一步研究铜和铝对黑曲霉生长的影响，在 PDA上接种黑曲霉菌， 将铜铝样片分别置于其表面，放置培养箱中，22(±2)°C培养10天，观察黑曲霉菌生长抑制现象（图 2）。铜样片周围发生黑曲霉菌生长抑制，但铝样片发生较严重生长现象，且生长范围较广。

讨论
       HVAC 系统在世界各地日益普及，然而这些系统对人体健康的影响有待深入研究多数研究表明，如果未能对空调机组进行妥善保养维护，可能更容易引发不良建筑综合症（PARAT等，1997；Perdelli等，2006）。在医院环境中，空气过滤系统仅在高效运转情况下，才能够为病人状况提供帮助（PerdelK等，2006； FALVEY 和 Streifel，2007）。

图 1 使用荧光显微镜观察分析，暴露 7 天后铜（C11000）（a）和铝（b）上面的黑曲霉孢子；暴露 4 天后（c）铜和铝（d）上的黄曲霉；暴露 4 天后铜（e）和铝 （f）上的烟曲霉菌。染色为橙色或红色的孢子和菌丝具有活性，染色为绿色或黄色的孢子和菌丝处于不活跃状态。

图 2 实验 10 天后铜和铝样片上黑曲霉菌生长抑制情况。将曲霉孢子悬浮液（100 lA）接种在 PDA 培养基上，再将铜铝样片分别放到培养基表面。 将培养基在 22（±2）℃ 环境温度下孵化 10 天。真菌在铝样片上生长（b），而铜样片周围真菌生长受到抑制（a）。

       除黑曲霉菌以外，所有真菌菌株测试研究均表明，与铝相比，铜表面上的真菌存活和生长现象较低。曲霉类真菌在空气样品中数量最多，而在已知曲霉菌种类中黑曲霉最为常见（Anaissie等，2003）。本文研究结果表明黑曲霉暴露于金属表面时具有更强适应能力，这或许可以解释以往研究工作中其发生率很高的现象。Anaissie 等人在 2003 年得出结论认为，医院空气中的霉菌来源于供水系统，而非外界空气污染引发。他们发现潮湿环境中采集的空气样本存在更多霉菌，如浴室，因此得出结论霉菌来自供水系统。潮湿的环境也可能会有助于空气中霉菌的生存和生长，这也解释了为何潮湿环境下存在较多霉菌。如果情况属实，则该现象也适用于 HVAC 系统和除湿机内的循环水。
通过采用 FUN -1 染色技术的原位荧光显微镜观察，铜表面的真菌菌株形态与铝明显不同。铜表面孢子未发生萌发并伴有菌丝死亡，这表明铜具有抑制真菌萌发以及杀菌效果。这对于黑霉曲菌尤其重要。黑霉曲菌是受测真菌中唯一表现出铜表面较长适应性的真菌种类，具有长时间铜表面耐受能力，孢子长时间保持活性并可以在PDA上进行分离和培养。与铝表面不同，通过原位荧光显微镜对比观察发现铜表面无真菌萌发，PDA培养的真菌无法在暴露的铜表面上进行繁殖。这表明铜表面对大多数受测真菌种类具有抑菌能力，对于黑曲霉也具有重要的抑制效果。
 

       目前还不清楚为什么黑曲霉孢子对于铜表面具有更强耐受性。目前有研究认为，真菌对于铜离子的耐受与酸性磷酸酶有关，因为菌丝在低于 1-mM铜离子浓度环境中生长 时，酸性磷酸酶可将金属转化为不溶性金属磷酸盐（Tsek- OVA等，2002）。实际上，对曲霉、青霉、梗霉和孢菌株的调查发现，黑曲霉产生酸性磷酸酶最多（Tarafdar等，1988）。Tsekova等人（2002）认为，作为周质酶，碱性磷酸酶的一部分以可溶形式存在，并分泌细胞外，参与金属离子析出作用，生成不溶性酸性磷酸盐。酶的另一部分附加于位于细胞壁附近细胞膜上，并参与铜（II）吸收过程，造成金属离子从细胞感受侧析出。铜离子浓度越高，磷酸酶活性受到抑制程度越高。当然，菌丝体生长过程受到铜离子抑制作用与磷酸酯有关，但孢子抑制机理可能并非如此，可能较其他菌株而言，黑曲霉孢子壁仅是对铜摄入更为抵制，限制铜离子的渗透至抑菌程度而非杀菌程度。虽然目前尚无黑曲霉与铜相互作用的相关报道，但Yang等（2004）研究认为黑曲霉孢子对镅元素有良好的吸收能力。
        相比培养分析，使用 FUN-1 染色分析技术明显有助于进行变化快速的实验结果分析(小于1天结果分析与采用培养分析的7-14天结果分析)。此前，有研究评估荧光探针在真菌和酵母菌活性分析中（Brul 等，1997；De Vos 和 Nelis  2006；Vanhee 等，2008）的可行性。据报道，与培养皿计数分析相比，用荧光活性分析方法可以在透析水中检测出更多真菌，可能表明真菌存在具有活性但无法培养（VBNC）的中间状态（De Vos 和 Nelis 2006； Vanhee等，2008）。
 

        尽管本文作者仅就采用 FUN-1 进行真菌活性染色分析方法作为活性检测方法进行潜在的应用评估，并未开展计数研究，但该分析方法先前已经过可行性验证（Brul 等，1997）。
        用铜替代铝作为 HVAC 系统内部构件材料，提供了控制真菌孢子生长和存活的潜在方法，从而降低了真菌感染和相关疾病传播的风险。对于 HVAC 风口通道曲折布放，难以进入通道进行有效清洁，或所使用清洁产品无法完全有效地去除或杀死真菌孢子以及偶尔进行空调清洗的情况，该方法尤其具有重要意义。

致谢
       本文研究工作由美国铜发展协会资助进行。感谢阿斯顿大学的 Steven Smith 博士为研究工作捐献真菌菌株。

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