温度和湿度对含银和铜抑菌材料抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抑菌效果的影响

H.T. Michels1, J.O. Noyce2 and C.W. Keevil2
1 Copper Development Association Inc., New York, NY, USA
2 School of Biological Sciences, University of Southampton, Southampton, UK
关键词
抑菌剂、效果、感染、MRSA、葡萄球菌、试验方法
通信地址
Harold T. Michels, Copper Development Association, 260 Madison Avenue, New York, NY 10016, USA.
电子邮件： hmichels@cda.copper.org
200^^0248: 2009年2月7日收稿，2009年3月20日修订，2009年3月23日录用
doi:10.1111/j.1472-765X.2009.02637.x
允许依照http://www3.interscience.wiley. com/authorresources/onlineopen.html所规定的条款和条件重复使用本文。

摘要

目的：通过评价温度和湿度对含银和铜抑菌材料抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抑菌效果影响，比较这两种已知具有抑菌性质的金属材料性能。
方法和结果：采用全球广泛使用的日本工业标准JIS Z 2801中所述的标准方法，在24h试验后，一种银离子的材料在相对湿度（RH）为>90%、温度为20°C和35°C的条件下使得MRSA存活率降低>5个数量级，但在22% RH和20°C条件下只降低了<0-3个数量级，在～22% RH和35°C条件下存活率没有降低。铜合金在所有试验条件下都造成存活率降低>5个数量级。
结论： 尽管JIS Z 2801中所采用的高湿（>90% RH）和高温（35°C）条件在该含银离子材料中产生了可量测的效果，该材料在室内环境中常见的低温低湿条件下未见明显反应。
研究意义及影响： 同含银离子材料在室内环境中常见的低温低湿条件下的低抑菌效果相比，铜合金在相同条件下表现出来的高抑菌性能支持其作为抑菌材料在医院等室内环境中的应用。

MRSA自从约30年前在医院中被发现以来，一直是一个严重的问题。据估计2005年美国侵袭性MRSA感染患者的人数约94650人，感染导致18 650位患者死亡（Klevens等，2007）。美国疾病预防与控制中心表示，该数字已经超过了艾滋病的致死人数。MRSA是一个重要的卫生问题，它已经不仅仅限于重症监护室(Klevens等，2007)，而是已成为一种严重的医源性感染或院内感染，扩散到了普通社区。尽管一般认为MRSA是通过患者和医护人员的手传播(Cimolai 2008)，越来越多的证据表明环境中的物体表面也可能是传染性细菌的一个重要载体（Casey 等，2008），促成了这些细菌的传播。

不仅仅在医疗领域，在家畜业中，MRSA感染也在持续引起人们的关注。这两种环境中，MRSA的出现都特别令人头疼。荷兰报道了一个与养猪场和养牛场有关的新的MRSA菌株，对猪进行的一项调查发现近40%携带该菌株（van Loo等，2003年）。在韩国，鸡和乳牛中已经发现有MRSA菌株的存在（Lee，2003年）。MRSA已经在家畜中站稳脚跟，并且有可能从家畜传染给农民（Lee，2003年），然后传播给大众。
社区获得性MRSA也是一个日益严重的问题（Klevens等，2007年），感染的人群一般比医源性MRSA感染的患者要年轻。MRSA不但在刚出院的个体中出现，也在其他没有明显风险因素的人群中出现。传播的途径包括皮肤小创伤，共用运动和个人护理用具，以及呆在狭窄拥挤的场所中等。学校、职业和高中体育场所、军队训练中心以及监狱中都曾爆发过MRSA感染。

一些具有抑菌活性的成分被引入各种材料，以削弱微生物在物体表面生长或生存的能力。采用抑菌材料作为环境中物体的表面有可能降低临床环境和其他环境中的MRSA水平。而环境表面上的MRSA水平的降低可能会减少这些表面随后同人体接触时传播到人体的细菌数量。铜合金已经被美国环境保护署（US EPA，2008年）注册为抑菌材料，允许合法对其提出公共卫生方面的权利要求。除此之外，据称还有其他一些材料，包括含银离子的材料，也表现出了抑菌抑菌效果。

含银离子的材料在JIS Z 2801（日本标准协会，2000年）所规定的35°C高温和>90% RH高湿度条件下具有明显的抑菌效果。本研究的目的是了解含银离子材料在医院室内环境中常见的较低温度和湿度条件下的抑菌效果。本研究采用铜合金作为对比，因为它们在医院常见的较低温度和湿度条件下显示出一定的抑菌效果（Noyce等， 2006年)。

材料和方法

本研究对两种商业含银材料进行了试验，但由于这两种材料是专利产品，我们无法提供完整的成分说明。为方便本研究起见，我们将第一种材料称为Ag-A，其生产商称该材料将“银离子混入沸石载体中”。沸石是具有微孔结构的铝硅酸盐矿物。第二种材料称为Ag-B，其生产商称该材料包含“作为活性成分的银离子置于有机基质中”。在Ag-A和Ag-B中，含有银离子的涂层采用商业化的工艺涂装到不锈钢基质上，将其作为试验样品来源。

五种铜合金和S30400不锈钢实验对照的成分由其UNS号标识，UNS号是一种被广泛采用的不锈钢标志法。铜合金和不锈钢的成分，以及其中一种含银离子材料Ag-A的银含量见表1。Ag-B的银含量未提供，尽管我们认为其标称含量等效于Ag-A，而Ag-A含有2.5%的Ag。将99.9%纯银纳入上述试验可能会有一些科学价值。但从实际出发，纯银因其低强度和高昂的价格而未被用作结构材料。 

所有样品材料都被切成1 X 1cm或2.54 X 2.54 cm大小的方块。合金样品在装有30粒直径2mm的玻璃珠的10ml丙酮中进行30秒的涡流除脂和清洗。清洗后，合金样品通过乙醇浸泡和火焰消毒，在接种前移入一个带盖的塑料容器中以防止污染。含银离子的样品清洗并浸酒精后不进行除脂和火焰消毒，以免损伤涂层。

试验第一阶段的目标是在典型室内条件下评价抑菌效果同暴露在MRSA培养液中的时间之间的函数关系。胰蛋白胨大豆肉汤用MRSA (NCTC 10442)接种后在37°C条件下培养16h。此后每个材料进行一式三份的试样接种作为一个数据点，每个试样浓度约为2 X 107 CFU，由系列稀释决定。接种后样品置入22 + 2°C或～22°C，以及50 + 10% RH或～50% RH的条件下，时间从15min到6h。暴露期结束后，在装有20粒直径2mm的玻璃珠的10ml无菌磷酸盐缓冲盐水中进行30s涡流除去样品上的有机物。为确定从样品上移除有机物的存活数量，我们从样品上移除100μl的有机物，然后进行系列稀释。琼脂平板用50μl的稀释液接种，稀释液平均涂布在表面上，置于37°C温度条件下接种18h，然后统计CFU的数量用于计算样品的平均CFU数量，该过程在其他文献中有详细说明（Noyce等， 2006年)。

含银离子材料等抑菌材料报告的结果通常基于在JIS Z 2801所推荐的35°C和>90% RH条件下进行的。获得24h试验所需的高湿度的方法是将一块塑料薄膜按压在样品表面的培养基上，然后将其置入有盖培养皿中以便保持水分。与此相对的是，铜合金通常在典型的实验室环境中进行试验，其温度约为20°C，环境湿度远远小于JIS Z 2801中规定的>90% RH。

试验第二阶段的目标是评价在JIS Z 2801（日本标准协会，2000年）试验条件以及其他温度和相对湿度条件下进行24h试验后的抑菌效果。实际的JIS Z 2801试验在35 + 2°C(～35°C)和>90% RH条件下进行24h。在湿度>90% RH和一个较低温度20 ± 2°C(～20°C)下重复试验。此外还针对实验室中常见的低湿度进行了两组平行试验。这些较低湿度的试验在空气中进行，未用塑料薄膜保持湿度。第一个试验在35 ± 2°C，15-24% RH条件下进行，第一个试验在20 ± 2°C，19-28% RH条件下进行。为简便起见，15-24% RH表示为～20% RH，19-28% RH表示为～24% RH。采用类似于上述试验第一阶段的标准微生物学方法对细菌进行培养，回收和统计。在本阶段中，AOAC合成肉汤在无菌条件下接受MRSA (ATCC 33592)接种，然后在37°C下培养过夜。培养基含有约6×108 CFU ml－1的MRSA及由5%胎牛血清和0.01%Triton X-100。每种材料或合金制备一式三份的试样胚，在要求的温度和相对湿度条件下接种并暴露24h。暴露后，回收、培养并统计剩余的存活细菌。试验温度和相对湿度条件下的24h试验期结束时，参照对照材料S30400不锈钢上的存活数量测量了所有其他材料中的细菌量减少。

结果

试验第一阶段的目标是评价含银离子材料和铜的抑菌效果同暴露在MRSA培养液中的时间之间的函数关系。具体来讲，以S30400不锈钢作为实验对照，在典型实验室温度～22°C和相对湿度～50% RH条件下对两种预先定义的含银离子材料Ag-A和Ag-B以及C11000铜的抑菌效果进行了测量。如图1所示，初步研究结果显示C11000铜在75min内造成细菌数量减少七个数量级，但360min时在两种含银离子材料Ag-A和Ag-B以及实验对照S30400不锈钢中未见明显减少。

在试验条件下，两种含银离子材料之间未见差异，且同实验对照S30400不锈钢之间的抑菌效果差异无显著意义。

完成试验第一阶段后，进行试验第二阶段以更好地了解含银离子材料宣称的抑菌效果，并进一步了解它们在一定温度和湿度范围内的抑菌效果。试验第二阶段包括按照JIS Z 2801规程测试两种含银离子材料之一Ag-A以及五种铜合金，仍以S30400不锈钢作为实验对照。此外还在JIS Z 2801规定的湿度水平>90% RH以及一个较低的温度～20°C下进行了24h抑菌效果试验。

在更低的湿度水平上进行了另外两次24h抑菌效果试验，第一次试验在～20% RH和～35°C条件下进行，第二次试验在24% RH和～20°C条件下进行，结果见表2。

在JISZ 2801试验条件～35°C和>90% RH下试验时，含银离子材料Ag-A中观察到>6.4个数量级的细菌减少，而同一材料在～20°C和>90% RH条件下只观察到5.5个数量级的细菌减少。

在较低湿度水平时，含银离子材料Ag-A在～35°C和～24% RH条件下未见细菌减少，在～20°C和～24% RH条件下有小幅度的<0-2数量级的减少。与此相对，在所有湿度和温度组合下，所有五种铜合金均在24h后显示了存活MRSA的>5.5到>6.4个数量级的减少。

讨论

表2给出的数据显示，含银离子材料Ag-A在JIS Z 2801的>90% RH、～35°C高温高湿条件以及>90% RH、～20°C条件下均表现出了一定的抑菌效果。但Ag-A在～20% RH、35°C条件下，尤其是在室内环境典型的～24% RH、20°C条件下未见显著的抑菌效果。这表明在评价用于典型室内环境的抑菌材料的抑菌效果时，JIS Z 2801并不是一种很适当的方法。在JIS Z 2801条件下的试验结果可能会误导消费者，使他们产生错误的信心，因为他们可能会误认为抑菌材料的抑菌效果适用于医院等室内环境。

最近Wood等（2007年）确认了含银离子材料在接近～24% RH和20°C的医院环境中抑菌效果的不足。经测定，由含银离子材料Ag-A制成的听诊器保护隔膜涂层的平均菌落数为每样本246.5，而未加涂层的听诊器隔膜菌落数为每样本71.4（Wood等，2007年）。由此可见，据称具有抑菌效果的含银离子保护层，实际上比无保护涂层的听诊器隔膜污染更为严重。Ag-A的这种抑菌效果不足可以从某种程度上解释含银离子抑菌材料未能获得US EPA注册批准用于公共卫生权利要求。Ag-A这类材料无法在美国提出合法的公共卫生领域的权利要求。不过它们可以按照“经处理的物品”豁免条款（美国环境保护署，2003年）提出权利要求。“经处理的物品”豁免条款提出，活性成分银可以保护含银离子涂层本身不受到变质和细菌侵袭的影响。

与含银离子材料形成鲜明对比的是，在按照三种美国EPA规程的测试中显示出对五种细菌的很强的抑菌效果后，抑菌铜合金最近被注册为具有公共卫生权利要求的固体材料（美国环境保护署，2008年）。 

（Michels和Anderson，2008年）。这五种细菌是金黄色葡萄球菌、大肠杆菌O157:H7、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、铜绿假单胞菌。EPA注册前的几项研究证明了铜合金对多种细菌和试验中的一种病毒具有很强的抑菌效果。这些生物体包括艰难梭菌(Weaver等，2008年)、大肠杆菌O157(Wilks等，2005年)和(Noyce等，2006b)、单核细胞增多性李斯特菌(Wilks等，2006年)、结核分枝杆菌(Mehtar等，2008年)、甲型流感病毒(Noyce等，2007年)。

尽管铜表面上细菌灭活的机理尚不明确，到目前为止所获得的结果显示干燥的铜表面上能够快速杀灭细菌。这种快速杀灭效果可能从一定程度上解释为什么不存在对铜具有明显耐受力的致病菌。几个世纪以来，铜已经被人类广泛应用在与人体接触的场合，使细菌遭受了致死性曝露。初步研究(Espirito Santo等，2008年)表明，细菌在干燥环境中不能及时地产生菌膜，而且这类环境中的压力和生存条件也与水系统有所不同。DNA损伤是一种可能的毒性机制。但Macomber等(2007年)曾报道，在对干燥铜表面毒性的一项研究中，“铜显然并不明显促进体内氧化性DNA损伤。因此铜的毒性一定是由其他机制产生的。” 因此我们可以推测，即便某生物体在水性环境中具有铜耐受力，也无法在干燥铜表面上存活。关于毒性机制的研究仍在进行中。

而铜合金对于多种细菌的强大而稳定的抑菌效果表明，这类细菌有必要在医院环境中作进一步的评估。为实现该目标，美国三个医疗机构正在重症监护室中进行协同临床试验。试验地点为纽约市纪念斯隆凯特琳癌症中心、南卡罗莱纳州医科大学、拉夫•约翰逊弗吉尼亚州医疗中心。后两个机构均位于南卡罗莱纳州查尔斯顿市。研究基金由美国国防部下属的远程医学和先进技术研究中心提供。在英国伯明翰NHS基金信托大学附属医院进行的临床试验（Casey等，2008年）中获得的初步结果显示，所有含铜样品的微生物数量均比对照样品少90-100%。该试验同样仍在进行中。

可以预见的是，这些试验的结果将进一步证实铜合金在医院环境中具有抑菌效果，有可能在控制造成医院获得性感染的细菌方面起到重要作用。 

致谢
本研究在国际铜业协会和美国铜发展协会资助下进行。

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